Real Time PCR: identificación de especies de origen animal

Por VÁZQUEZ, Natalia; BACHUR, Sandra; BELLO, Marcelo; BINOTTI, Susana (*)

Introducción

La sustitución de determinadas materias primas de origen animal en alimentos para consumo humano por otras de menor valor comercial, constituye una adulteración que puede derivar tanto en un fraude comercial como en un riesgo para la salud del consumidor.

Los métodos más empleados para la identificación de especies animales en carnes y productos cárnicos procesados se basan en el análisis de proteínas (técnicas electroforéticas, cromatográficas e inmunológicas) y en el análisis de ácidos nucleicos (PCR, Real Time-PCR). Las principales ventajas de las técnicas moleculares son la mayor estabilidad de la molécula de ADN frente a los tratamientos térmicos y que el resultado no depende del tejido analizado, ya que todas las células del organismo poseen la misma información genética.

Actualmente la determinación del origen animal de los distintos componentes presentes en un alimento mediante la identificación específica del material genético es una de las metodologías más empleadas para el control de de los mismos.

La puesta a punto de métodos moleculares rápidos y robustos que permitan la identificación de diferentes especies animales es de gran interés para la detección de adulteraciones y/o productos incorrectamente rotulados.

En particular, la técnica de Real-Time PCR utilizada en la identificación de especies está basada en la extracción, amplificación y detección de ADN mitocondrial específico de cada especie animal estudiada (Tartaglia, M y col.1997).

El objetivo de este trabajo fue la optimización de las condiciones de análisis de un método de Real Time–PCR, desarrollado para la detección e identificación de las especies vacuna, ovina, porcina, aviar y equina, utilizando sistemas modelos con muestras elaboradas en el laboratorio.

Materiales y Métodos

Preparación de muestras y extracción del material genético

Para la realización del ensayo se utilizaron muestras elaboradas al 10% con patrones cárnicos crudos de especies vacuna, ovina, porcina, equina y aviar previamente procesados durante 110 minutos en baño de agua a ebullición.

Para cada muestra a analizar se pesaron 0.5 gramos y se realizó una digestión con proteinasa K durante 90 minutos a 60ºC en baño termostático. La extracción del ADN mitocondrial especie-específica fue realizada en fase sólida con sílica grado biología molecular.

Primers y sondas

Se utilizaron primers específicos de cada especie animal para la amplificación del material genético y sondas de hidrólisis de mamífero (para las especies vacuna, ovina y porcina), de ave y de equino con marcadores de fluorescencia FAM-TAMRA Y TET-TAMRA para su detección. Las secuencias de bases para cada uno de los primers y sondas se detallan en la Tabla 1.

Las concentraciones óptimas de primers y sondas utilizadas se determinaron en ensayos previos.


Tabla 1: Secuencias de primers y sondas especie-específica utilizadas.

Amplificación y detección

Para las reacciones de amplificación se utilizó la master mix QuantiTect Probe PCR kit con Uracil-N-glycosylase (UNG) marca Qiagen con un volumen final de 20 ul por reacción.

La identificación de las especies analizadas se realizó utilizando un equipo de Real-Time PCR Light Cycler 2.0 de Roche. El programa correspondiente a los ciclos de tiempo y temperatura empleados en los ensayos se detalla en la Tabla 2.

La amplificación del material genético especie-específico se detecta monitorizando el aumento de la fluorescencia por hidrólisis de las sondas utilizadas.


Tabla 2: Ciclos de tiempo y temperatura empleados en los ensayos.

Diseño Experimental y análisis por superficies de respuesta

Con el objeto de optimizar distintas variables de la metodología propuesta se utilizó un diseño experimental de tres factores con tres niveles, para cada especie estudiada.

Las condiciones experimentales testeadas en este caso fueron: el volumen de muestra (Vm), la temperatura de annealing (Ta) y la concentración de cloruro de magnesio (CMgCl2). El rango de los niveles fue determinado en ensayos previos a la realización del diseño.

Los resultados fueron analizados por el método de superficie de respuestas (RSM) utilizando el paquete estadístico Statgraphics.

Resultados

A partir del análisis por RSM de los resultados obtenidos para cada especie animal, los parámetros se optimizaron considerando el valor mínimo de Cp (crossing point) para todo el rango estudiado a una concentración de 10g de masa patrón de cada especie analizada en 100g de matriz.

La Figura 1 corresponde a una corrida característica de la técnica de Real time-PCR para varios puntos del diseño de la especie aviar y para blancos de reactivos.


Figura 1: Gráfico de Fluorescencia vs. Número de Ciclos para la especie Aviar y blancos de reactivos.

El análisis estadístico de los diseños factoriales realizados para las cinco especies animales estudiadas muestra un buen ajuste de los datos experimentales con coeficientes de correlación mayores a 0.9 en todos los casos (Tabla 3).

Por otra parte, en la Tabla 3 se detallan los valores óptimos de las tres variables analizadas que surgen del estudiado por RSM y los valores de Cp, confirmados experimentalmente por triplicado, que fueron en todos los casos menores a los 20 ciclos.


Tabla 3: Valores óptimos de Cp obtenidos experimentalmente para todas las especies a partir de las variables óptimas del diseño.

Conclusiones

Mediante el empleo de una técnica cualitativa de PCR en Tiempo Real y con la utilización de primers y sondas especie-específica diseñadas a partir de ADN mitocondrial, ha sido posible la identificación unívoca de carnes aviar, porcina, vacuna, ovina y equina en alimentos.

Los distintos ensayos muestran que con la utilización de primers y sondas específicas y la optimización de ciertas variables experimentales (volumen de muestra, temperatura de annealing y concentración de cloruro de magnesio), se pueden analizar gran variedad de especies de interés con alta especificidad y alta sensibilidad reflejada en los bajos valores de Cp obtenidos a la concentración estudiada.


Referencias Bibliográficas

Dooley, J.; Paine, K.; Garrett, S.; Brown, H.(2004). Detection of meat species using TaqMan real-time PCR assays, Meat Science, (68), 431-438.

Kesmen, Z.; Gulluce, A.; Sahin, F.; Yetim, H. (2009). Identification of meat species by TaqMan-based real-time PCR assay, Meat Science, (82), 444-449.

Tartaglia, M; Saulle, E; Pestalozza, S; Morelli, L; Antonucci, G; Battaglia, P. (1997). Detection of Bovine Mitochonfrial DNA in Rumiant Feeds: A molecular Approach to Test for the Presence of Bovine-Derived Materials., Journal of Food Protection, Vol 61, N 5, 1998, 513-518.

(*) VÁZQUEZ, Natalia; BACHUR, Sandra; BELLO, Marcelo; BINOTTI, Susana Coordinación de Aprobación de Productos Alimenticios de Origen Animal y Conexos DLA, DILAB, SENASA mabello@senasa.gov.ar