Garantizar la detección de microorganismos retenidos

Mediante un kit confiable, para la concentración y extracción de ADN para líquidos, es posible detectar cada microorganismo que fue retenido por la membrana.
Por: Dr. Alexandra Mueller-Scholz* y Kai Nesemann**

Microorganismos retenidos

La Legionella es una bacteria patógena encontrada tanto en sistemas artificiales y naturales de agua que causan enfermedades pulmonares. Especialmente en sistemas artificiales de agua tales como en tuberías para la distribución de agua caliente o en torres de refrigeración; La Legionella puede proliferar excesivamente, lo que puede causar casos aislados de enfermedades o incluso brotes.

Las torres de refrigeración son equipos comunes utilizados para la refrigeración en locales industriales o grandes edificios públicos como hospitales. Un ambiente favorable para la Legionella es el agua con temperatura entre 20 y 45°C que contiene componentes nutricionales como sedimentos, escamas, lodos o biopelículas, lo que ocurre frecuentemente en sistemas artificiales de agua.

Hay dos métodos comúnmente utilizados para detectar la contaminación por Legionella en agua: (1) membrana de filtración clásica con las colonias de recuento en caliente subse y (2) técnica de amplificación de ácido nucleico (NAT) con pruebas basadas en Por reacción en cadena de la polimerasa (PCR). El método de filtración por membrana con recuento de colonias requiere un tiempo de incubación de al menos cinco días (ver figura 1).

El tiempo de cultivo es el gran desafío al utilizar el cultivo clásico como método de detección. Además, las pruebas de fluorescencia de células (por ejemplo, la microscopía de fluorescencia) demostraron que el método de recuento subestima el número real de células por varias dimensiones debido al estrés o aglomeración de las células [1] [2] [3]. Los NATs no dependen de cultivo, no requieren la necesidad de largos tiempos de incubación o del incómodo conteo de colonias. Entonces, ¿por qué no reducir el tiempo que usted necesita para esperar resultados de días o semanas para sólo unas horas? Aunque muchas estrategias diferentes están disponibles para la recuperación de contaminantes de la membrana, tales como el lavado.

Para clarificación de bacterias retenidas de la membrana, el Microsart® Geneprep es el único kit que garantiza la recuperación completa debido a la disolución de la membrana. Algunos suministros recomiendan recuperar las bacterias capturadas por lavado -aclaración, en contraste, el Microsart® Geneprep es el único kit que garantiza una tasa de recuperación completa debido a la disolución de la membrana. Hasta ahora, la falta de sensibilidad y el pequeño volumen de muestra en la prueba NAT han limitado su uso en la detección de microorganismos.

Este estudio presenta dos opciones para estas limitaciones. Se compararon dos kits de filtración de muestras y extracción de ADN en líquidos de 100 ml en términos de sensibilidad.

 

Configuración Experimental y Resultados

Se inoculó Legionella pneumophila en la muestra de agua a una concentración de 105 células por 100 ml. La filtración de muestras de 100 ml de agua con residuos de ADN aislados se realizó en paralelo, de acuerdo con las instrucciones de uso del kit del proveedor P y del Microsart® Geneprep de Sartorius [4] [5]. Ambos kits de preparación de muestras están listos para su uso y análisis de ADN. En el análisis posterior para evaluar la eficiencia de extracción de ADN de los métodos de preparación de la muestra, se utilizó el AquaScreen® LegionellaPCR en tiempo real (proveedor: Minerva Biolabs GmbH). Los valores de Ct se determinaron y compararon para ambos productos. Una descripción general de las diferentes etapas del kit del proveedor P y del Microsart® Geneprep Sartorius está disponible en la tabla I.

Los resultados de las pruebas de benchmarking se pueden encontrar en la tabla II. Todas las muestras salpicadas se probaron positivamente para Legionella en ambos métodos utilizados. Los valores de Ct de las muestras procesadas con el producto del proveedor P siempre se compararon con el Ct de muestras procesadas con el Microsart® Geneprep. Delta-Ct (∆Ct) se calculó utilizando los valores medios de cada método: ∆

∆Ct = (promedio-Ctsupplier P) – (promedio-CtMicrosart® Geneprep).

Todas las pruebas se realizaron con repeticiones de al menos cuatro veces (n ≥ 4).

Para la detección de Legionella pneumophila en la muestra, utilizando Microsart® Geneprep y el producto del proveedor P en paralelo, se determinó una media de ∆Ct ~ 2,8.

En general, se puede considerar que: cuanto mayor sea el valor de ∆Ct, más alta es la sensibilidad final de la tasa de recuperación del procedimiento. La ∆CtDe ~ 3,3 corresponde a una sensibilidad mejorada de cerca de un nivel logarítmico. Esto resulta en una tasa de recuperación aumentada en siete veces (2 (2 (2,8) ≈ 7) para Microsart® Geneprep en comparación con el producto del proveedor P Tabla II.

Conclusión

Microsart® Geneprep es un sistema de preparación de muestras para la prueba de Legionella. Se puede alcanzar un aumento de la sensibilidad de hasta siete veces puede alcanzarse cuando se utiliza el kit Microsart® Geneprep en comparación con el producto del proveedor P. Nuestros estudios han demostrado que la detección de Legionella con el kit de PCR AquaScreen® Legionella puede ser aumentada por el factor 7 al utilizar el kit Microsart® Geneprep para la preparación de muestras.

Por esta razón, el kit Microsart® Geneprep para la preparación de muestras es la mejor solución para obtener alta sensibilidad y resultados rápidos de detección en combinación con el método de detección por ADN. Esto es porque las pruebas de detección son tan sensibles como el método inicial de preparación de la muestra. Si las células bacterianas se pierden directamente después de la filtración de muestras debido a las bajas tasas de recuperación del filtro de membrana, la sensibilidad de su método de elección para detectar las células bacterianas no importa, debido a que ya ha perdido la mayoría de sus analitos durante la preparación de la muestra. En contraste, el kit Microsart® Geneprep ni siquiera intenta recuperar todos los microorganismos retenidos en el filtro, ya que esto es una tarea casi imposible. En su lugar, este kit incluye un filtro que garantiza que cada micro-organismo puede ser recuperado en solución para posterior aislamiento del ADN y detección.

Referencias

[1] H. M. Davey, Applied and Environmental Microbiology, 2011, Vol. 77, No. 16, p. 5571-5576
[2] M. A. E. Auty et al., Applied and Environmental Microbiology, 2001, Vol. 67, No. 1, p. 420-425
[3] D. Hoefel et al., Journal of Microbiological Methods, 2003, Vol. 55, No. 3, p. 585-597
[4] PALL GeneDisc Technologies, Extraction Protocol GeneDisc DNA Extractor®, Version July 2010
[5] Sartorius, Instructions for Use Microsart® Geneprep, Publ. No.: SL-6028-e160602, 06/2016
[6] Minerva Biolabs, Instructions for Use AquaScreen® Legionella specc., 09/2012.

*alexandra.mueller-scholz@ -Sartorius-Stedim.com -Sartorius Stedim Biotech GmbH

**kai.nesemann@sartorius.com -Sartorius Lab Instruments GmbH & Co. KG. Evaluación de Microsart®